rna提取【RNA的提取方法】
RNA的提取方法
酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。提取称取鲜酵母159或干酵母粉5g，倒入100ml三角瓶中，加NaCl5g，水25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取lh。分离将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r／min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。RNA抽取一般使用Trizol法抽提:Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理:在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。提取RNA的方法有硫氰酸胍分离法等。
提取RNA及PCR步骤
加2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。12000×g，4℃离心，15min。吸上层无色水相，移入另一EP管中（约5ml）。加等体积异丙醇，-20℃，30min。12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀弃上清，加75％乙醇1ml，振荡。加RNA模板（在核酸提取区）将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。RT-PCR反应将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR扩增。样品RNA的抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入2ml的，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。
mRNA提取注意事项
此法利用mRNA3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。提取的总RNA必须完整,不能被降解,这是mRNA质量的先决条件。总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当,过量的总RNA,容易造成mRNA不纯。：成功提取mRNA，最关键的问题是抑制RNA酶活性。因为mRNA呈单链状，容易受到核酸酶的攻击。异硫氰酸胍法(TriZol)原理：TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。注意事项：从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μgRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
简述RNA提取方法及其注意事项。
尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。真空离心干燥3—5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。沉淀用30μlDEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68℃处理10min。RNA检测测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/mlRNA计算RNA的产量。OD260/OD280在8-0。避免加热，低温溶解RNA，如需加热，控制在40°C。FreeZol法与TRIzol类似，先混匀匀浆，离心后取上清，加异丙醇混匀后离心，再用乙醇清洗并晾干或稀释溶解。质量控制与污染评估使用紫外分光光度计检查RNA的质量，A260/A=约0代表纯RNA，低于0可能有蛋白质污染。还要注意溶液pH的控制了，RNA蛋白溶于碱，DNA蛋白溶于酸。提纯的话因为溶液中有DNA，首先要先高温加热且温度要迅速达到80以上使DNA变性，30分钟左右后，拿出来再骤冷防止其复性。 取出吸附柱，放入新的无RNA酶的5mL离心管内，加入30-50μL洗脱液，静置3分钟，000rpm 4℃离心2分钟，收集RNA溶液。 -70℃保存，或直接用于下一步实验。
dna提取和rna提取的异同
RNA分子量小，集中于细胞质中，易分解。DNA分子量较大，集中于细胞核中，化学性质稳定。在提取RNA过程中必须放置RNA的降解。提取RNA与提取DNA方法的区别与联系如下：提RNA要用depc水，要避免RNA酶，要去DNA，抽提的时候用水饱和酚。DNA用一般的水就可以了，其他的都不是很严格，不用去RNA，抽提的时候用酚氯仿。RNA操作时要求比较严格，用具都要灭菌灭得很干净，戴手套操作，少说话以防把口水滴入实验样品。两者都采取核酸分子杂交技术，只不过基因组DNA是从基因库中利用杂交技术提取所需DNA，细胞RNA则是在细胞层面操作。先大致说一下区别，DNA中有基因和基因间区，而基因中包含编码区和非编码区，编码区中有内含子和外显子，转录成RNA时候，高等生物发生转录时，都会将内含子等基因片段转录的RNA片段经过修饰切除，而保留外显子所转录出来的RNA片段，这个片段就是你提到的从供体中提取出的RNA片段。
从RNA抽提到制成cDNA的全过程
用亲和层析法得到mRNA后，根据mRNA分子的3'端有poly(A)尾结构的原理，用12~20个核苷酸长的oligo与纯化的mRNA混合，oligo（dT）会与poly(A)结合作为反转录酶的引物，随机引物法合成的产物也是RNA-DNA的杂交体。逆转录：cDNA第一链合成主要是为了获得DNA的反向互补链。在RNA存在的情况下，它通过逆转录酶的作用，将RNA转化为cDNA。这个过程被称为逆转录，是生物分子研究中的重要通过逆转录，我们可以将RNA的序列信息转化为DNA，以便于进行更深入的分子生物学研究。：提取RNA，以oligodT在M-MLV反转录酶的作用下引导反转录合成cDNA，用TdT在合成的cDNA末端加上polyC尾，在反应体系中加0μL的TdT于37℃反应15min以加尾的dC-cDNA为模板，用接头引物AdapterdG分别和基因特异性引物进行PCR，扩增基因5'末端。其生成过程颇为独特：在有引物的条件下，逆转录酶如同一个魔术师，将mRNA上的遗传信息忠实复制为单链cDNA。接着，这个单链经过碱性处理，去除原有的RNA模板，然后作为模板，再次通过DNA聚合酶的作用，形成完整的双链cDNA，这样的过程就像DNA的自我复制，但起始于RNA的信息。
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