ncbi引物设计教程【2022-03-16引物设计及在线验证】

2022-03-16引物设计及在线验证

网址引物设计和验证的推荐网站为：Primer-Blast。这是一个专门设计用于在已知序列上设计引物或探针的工具。使用BLAST-Primer，您可以输入一个序列或一组序列，并为这些序列设计引物或探针，以便用于PCR扩增或杂交检测等分子生物学实验。需要注意的是，NCBI还有一个网站叫：BLAST。注意二者不要弄混。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第三位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。引物5’端可以修饰。引物5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。Primer-Blast验证引物结果的意义是：可以准确判断一对引物是否能够将该基因的所有转录变体覆盖到。NCBI的引物设计工具凭借基因序列直达引物设计的入口、其丰富的设置选项。特异性预测的功能还是得到了广大科研工作者的青睐，熟悉掌握了该工具，将为您的分子生物学实验起到很大帮助。

如何设计简并引物?

⑩引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。引物3′端要避开密码子的第3位。引物3′端不能选择A，最好选择T。碱基要随机分布。引物自身及引物之间不应存在互补序列。根据保守序列，按照简并引物设计原则，设计成对引物。（这个要学习一下如何从氨基酸翻译成核苷酸）将序列给公司，进行合成。利用软件设计引物。当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用primer0进行设计。简并引物通俗的讲是不完全相同的引物序列的混合物。使用简并引物是为了增强引物的通用性，即不同DNA序列的目的基因都可以用这种引物进行PCR扩增。—COPY特异序列到GeneTank——Primer——Search——PCRPrimers，Pairs——设定Senseprimer和Antisenseprimer的范围及PCR产物大小范围——设定引物长度（primerlength）——Automatic——OK——Searchcomplete后点OK——在SearchResults里选择引物对。

引物设计方法

①特异性：引物应在保守区内设计并具有特异性，引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。②引物长度：一般在15~30碱基之间，引物有效长度Ln=G+C)+A+T，Ln值不能大于38。如何利用Primer0进行引物的设计？首选取目的基因序对格式没有什么要求,只需要将目的基因序列复制就可以。打开File目录下的New,选择Sequence。这里的另一个Project选项是导入文件的方式,也就是将目的基因以文件形式保存的可以直接导入文件。一般通过复制的方式会更方便。引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

求助保守序列查找,引物设计

一般对于已知序列的PCR当然不要从保守序列来设计引物，只要从开放可读框前后开始设计就行了。看看目的基因的参考文献，文献里通常会提到哪些区段比较保守。如果没有参考文献，就比较不同物种的该基因，看看哪些片段同源性最高，同源性最高的就是保守区段。选择核苷酸序列的保守区设计引物，其一是为了防止PCR扩增时由于序列变异而导致的PCR假阴性；其用一对引物就可以应用于不同菌（毒）株（物种、区域）来源样品中某一特定核酸序列的PCR鉴定。上NCBI做BLAST，网页链接在页面左上角的方框里贴入基因序列，在下面的organismoptional里面选择物种，点击最下面的BLAST按钮就行了。结果里面同源序列越多，就越保守。让我们从选择合适的工具开始：SnapGene虽然自身并不直接提供引物设计功能，但你可以借助其他专业软件，如Oligo6或Primer5。它们都有详尽的使用教程和下载资源，只需稍加搜索，就能轻松上手。设计原则是关键：一个好的引物应遵循一些基本原则。

LncRNA 过表达慢病毒载体引物设计

构建lncRNA过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。然而有些lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。要进行shRNA载体构建，首先需要根据自己的基因，设计出对应的靶点、loop序列，酶切位点序列，详见LncRNA的shRNA慢病毒载体引物设计-引物先用10000g在4°离心2min，再按照说明书的要求，加入DEPC或者无酶ddH2O将寡核苷酸稀释为100μM。基因功能研究实战：以人pyrin基因为例，构建pWPI-eGFP-pyrin慢病毒过表达载体。根据研究目标选择合适的基因亚型，并从NCBI数据库获取CDS区域。接下来，通过粘性末端克隆法，如PacⅠ和PmeⅠ酶切，设计引物进行PCR扩增，连接到pWPI质粒，然后进行单克隆筛选和验证。上面介绍的pcDNA1和PX458均是瞬时表达载体并不能在人类等细胞中进行复随着细胞的分裂,单个细胞中的质粒不断的被稀释,因此这些载体只能起到瞬时表达的效果。而慢病毒表达载体则可以介导表达元件整合到人类细胞的基因组这些表达元件可以随着基因组DNA的复制而复因此可以实现稳定表达。

简并引物 设计软件

PrimerPrimerPremier，作为分子生物学界的得力助手，由Premier公司精心打造。这款专业软件以其直观的界面吸引着科研者，包括序列编辑（Genetank）、引物设计（PrimerDesign</）、酶切分析和DNA基元分析等功能。0版本已升级至新增智能特性。NoePrimer03独特的引物设计软件PrimerPremier0DEMO序列分析与引物设计,非常棒的一个软件。Oligo36Demo引物设计分析著名软主要应用于核酸序列引物分析设计软件。PrimerD'Signer1免费的引物设计辅助软专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载简化引物设计工作。当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用primer0进行设计。但最好使用专门的简并引物设计的方法如：CODEHOP（另外功能是同源性分析（Allign），并非premier的特长，在此略过。该软件还有别的一些功能，如序列“朗读”，DNA与蛋白序列的互换（Protein），发声提示键盘输入等，但是其中最优秀的缺失能设计简并引物。

在本文中，我们探讨了ncbi引物设计教程和2022-03-16引物设计及在线验证的各个方面，并给出了一些实用的建议和技巧。感谢您的阅读。